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作者：王硕，南京农业大学硕士在读，主要研究利用噬菌体防治土传病害。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍作弊者病毒之间的竞争及其机制，原文于年8月发表在ScienceAdvances。

导读“作弊”病毒（也称为缺陷干扰病毒）不能自行复制，但在共同侵染时比野生型复制更快。在研究中（MS2噬菌体的实验进化过程），作者观察到出现了两个不同的突变体“作弊者”。第一个是点缺失突变体，缺乏聚合酶活性，但在病毒包装中具有优势；第二个同义突变“作弊者”涉及改变的RNA结构。持续进化过程呈现了缺失“作弊者”的消亡和同义“作弊者”的崛起。数学模型推断出，虽然单个“作弊者”可能与野生型达到平衡，但共同侵染的“作弊者”之间的拮抗互作导致了“作弊者”的消亡。这些发现突显了不同水平的寄生作用：病毒寄生于细胞，“作弊者”寄生于完整的病毒，“作弊者”可能寄生于其他“作弊者”。

实验过程中“作弊者”迅速出现

作者从单个MS2噬菌斑进行了15次连续传代，设置两个生物学重复，分别表示为A和B线。通过重复的深度测序确定群体中的突变频率。首先寻找适应性突变（频率随时间迅速增加）（图1A和B）。结果发现位置（Δ）处的单个核苷酸缺失频率在两个重复中均达到50%。这种突变影响了MS2基因组的两个重叠阅读框（图1B），并且在缺失处的上游或下游未观察到可以纠正异常阅读框的额外插入或缺失。Δ可能产生三个独立的影响（图1C和D）。首先，由于缺失发生在该基因的第二个密码子上，它将完全消除功能性复制酶蛋白的表达，而复制酶蛋白对于MS2复制周期至关重要。其次，由于Δ也影响裂解蛋白的重叠阅读框，因此可能形成该蛋白的截短形式，该截短形式仅包含N端和几个其他氨基酸。复制酶基因的改变可能重建裂解蛋白的C末端部分（图1D）。最后，该缺失直接影响称为TR环的RNA二级结构，该结构在病毒复制周期的最后阶段与外壳蛋白相互作用，并启动病毒体组装（图1C）。作者推断Δ没有功能性复制酶蛋白并怀疑这是一种“作弊”病毒。图1MS2的高频突变

缺失突变的机制

作者进一步验证Δ存在缺陷并且不能单独复制。他们将初始的单个噬菌斑与第15代病毒（p15A和p15B）一起接种。对20个噬菌斑进行深度测序（每行10个），没有检测到Δ（图2A）。检测到的唯一突变是AG。RNA测序表明，Δ和AG是独立的且其基因组是不同的，大多数其他突变与Δ和AG相关。原因可能是在原始复制酶开放阅读框的中间创建了另一个阅读框（图1D）。种群中有两个主要的“作弊者”（图2B）。“作弊者”的特征之一是依赖共同侵染。MOI越低，共同侵染率越低。作者以较低的MOI（噬菌体吸附并感染宿主菌之前，噬菌体同宿主菌之间数量的比值）培养了p16（第16代噬菌体），同时保持足够的种群大小（图2C和D）。在MOI为0.1和0.01时，除AG以外的所有突变频率均急剧下降。MOI为0.01时，此效应更显著。证明他们确实存在缺陷并依赖野生型（WT）才能复制。接下来，作者探究哪个缺陷导致病毒无法依靠自身进行感染。他们从p15B种群（相对丰度最高的Δ和AG种群）中接种了病毒，再从噬菌斑中收集病毒，选择不会在WT宿主菌株上形成噬菌斑的病毒并进行了测序。在使用Sanger测序的5个噬菌斑中，3个含有Δ，2个含有AG。从WT宿主菌株分离出的20个噬菌斑中没有这些突变体（图2B）。添加具有活性的RNA复制酶后，作者成功地分离了Δ突变体，表明这两个截短的裂解多肽足以裂解宿主细胞。辅助复制酶的表达与野生型病毒感染期间的复制酶表达不同，并且完全改变了病毒种群的选择性压力。因此，缺乏复制酶是Δ的主要缺陷。图2缺陷突变的两个主要谱系

缺失突变体机制的优势

Δ在两个重复中的频率都明显增加，表明在共同侵染期间，它具有复制方面的适应性优势。作者着手测试Δ基因组是否被优先复制，具体机制可能是改变了影响复制的RNA的二级结构。首先通过qPCR证实了在15和30min后已经进行了基因组复制，并且早于细胞裂解。接着用来自B系的不同代种群（5、8、10、13和15）感染细胞，并在0、15、30min和过夜4个时间点对细胞内基因组进行了测序。结果显示Δ的复制劣势很明显。具体表现为在15和30min之间Δ的频率急剧下降，而在WT/AG或AG中没有观察到这种现象（图3A）。在过夜生长后测定Δ的频率时，作者发现其频率再次上升，表明其优势在于复制后。为了验证Δ是否具有包装优势，作者使用微量热泳动法测定了WT和Δ序列构成的TR环RNA与MS2外壳蛋白的结合能力。结果表明，外壳蛋白对ΔRNA的亲和力明显高于WTRNA（图3B）。在与WT共侵染过程中，结合亲和力的差异可能导致优先包装Δ基因组。图3赋予Δ优势的机制

另一种部分“作弊者”的突变机制

作者将AG定位为另一种欺骗性突变即同义突变。从添加辅助质粒的样品中分离出的AG突变体能够产生微小的噬菌斑，然而在不含辅助质粒的WT细菌上生长时几乎看不到噬菌斑。这种现象与依赖WT的现象（图2C和D）都表明了AG是不同于缺失突变体的部分“作弊者”。进一步推断出AG突变体的优势在于复制后，因为其细胞内复制速率与WT相似（图3A）。AG的同义取代位于外壳蛋白中，但该位置也是裂解蛋白和RNA茎环结构部分的核糖体结合位点（RBS）的第一个位置（图4B）。预计RBS处的突变会减少核糖体结合并改变RNA结构（图4B），从而导致RBS的易接近性降低。为了测试这一点，作者构建了带有WT或AGRBS和周围RNA结构的合成质粒，RNA结构融合了绿色荧光蛋白（GFP）（图4C）。结果表明，AGRBS导致GFP的表达明显降低（图4D）。此外，AGRBS的表达与不携带质粒的细菌的表达相同，这表明RBS的易接近性极低。图4第二个部分“作弊者”接管了病毒种群

病毒间冲突动态的数学建模

作者通过数学模型推断出一些结论。首先，在WT共感染中，两个“作弊者”都具有优势（w1）。缺失突变体的适应性始终高于AG（图5B和C）。在AG存在的情况下，Δ几乎不能复制（甚至根本无法复制）（图5B）；存在Δ的情况下，AG的复制效果是不可知的。但是，在交点（图5A第15代）后部90%的区域中，Δ的复制效果不如AG。在三重感染期间（WT、Δ和AG），模型的推论同样认为两个作弊者之间存在这种不平衡，这种情况很可能在约13-15代中普遍存在（图5B和C）。总而言之，两个“作弊者”之间的相互作用导致我们在两个重复中看到了意外的消亡和上升模式。当两者共同侵染细胞时，AG的复制比Δ更成功。换句话说，AG成功欺骗了Δ，反之亦然。图5“作弊”病毒的动力学建模总结本文通过连续传代培养的方法成功培养出了病毒突变体并通过测序技术发现了它们的突变位点，然后进一步推断这些“作弊”病毒的机制及适应性优势机制，最后通过数学模型预测“作弊者”的上升或消亡模式。这种研究思路可以借鉴到青枯菌噬菌体的研究中，青枯菌噬菌体在长时间的进化过程中也会出现这种“作弊者”突变体，“作弊者”的种群数量可能会影响到噬菌体疗法的效果，了解它们的变化规律可以提高噬菌体疗法的稳定性。论文信息原名：Competitionbetweensocialcheatervirusesisdrivenbymechanisticallydifferentcheatingstrategies译名：不同的欺骗机制驱动“作弊”病毒之间的竞争期刊：SCIENCEADVANCESIF：13.发表时间：.08通讯作者：AdiStern通讯作者单位：特拉维夫大学猜你喜欢如何科学地开发土壤微生物菌剂？噬菌体——人体肠道健康和免疫力的操纵大师巨型噬菌体新发现-利用宿主间接影响淡水环境中甲烷循环拟杆菌噬菌体的分离及其宿主范围预测盘根错节的微生物“社会”——噬菌体及其细菌宿主病毒组研究的挑战-相关的新兴技术细菌和噬菌体那些事儿——没有永恒的剥削，只有无尽的相互利用“花非花，雾非雾”：噬菌体表示交互喂养关系绝不简单！南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队微生态与根际健康实验室LabofrhizosphereMicro-ecology立足国家需求，探索学科交叉，引领国际前沿开展微生态研究、致力于根际健康提升、培养一流创新人才竞争求发展，合作谋共赢CompetitionCooperation感谢您的

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